Senin, 28 Januari 2013

Isolasi & Penentuan Struktur Senyawa STEROID Dari Akar Tumbuhan CENDANA (Santalum album Linn)



Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki hutan tropis yang amat luas dan negara kedua terkaya dengan keanekaragaman hayati sesudah Brazilia. Salah satu kekayaan hayati itu adalah tumbuhan Cendana (Santahum album Linn) yang hidup di daerah Samarinda, akarnya digunakan sebagai obat tradisional dalam mengobati penyakit diabetes mellitus. Senyawa steroid yang telah dilaporkan dalam S. album terdapat dalam daun yaitu β-sitosterol (steroid) dan dalam kulit batang yaitu amirin palmitat (triterpenoid ester).       
Adapun manfaat dari pohon Cendana itu sendiri, diantarany:
a. Kayu:
Antiseptik saluran kemih, disentri, mencret, radang usus.
b. Daun: Asma.
c. Kulit kayu/Kulit akar: Selain untuk obat, Cendana dapat dimanfaatkan untuk bahan kosmetika. Minyak Cendana juga digunakan sebagai obat gosok (dicampur dengan minyak kelapa). Minyaknya mengandung santalol. Kayunya (yang dipelihara sampai berumur 20 - 40 tahun) dijadikan perhiasan, patung, kipas, kotak cerutu dan alat rumah tangga lainnya.
Pada makalah ini akan dibahas mengenai isolasi dan penentuan struktur molekul steroid dari akar cendana (Santalum Album Linn).[1]

I.          RUMUSAN MASALAH
A.    Pengertian Steroid
B.     Isolasi Bioaktifitas Metabolit Sekunder
C.     Penentuan Struktur Senyawa Steroid
D.    Bioaktifitas Senyawa Steroid

II.                PEMBAHASAN
A.    Steroid
Steroid merupakan kelompok senyawa organik hasil alam yang berasal dari tetrasiklik triterpen.

Pada steroid struktur dasarnya berupa siklopentaperhidrofenantrena (4 cincin) dan merupakan bagian dari lipid, biasanya terdapat di tumbuhan, fungi dan hewan. Beberapa senyawa triterpenoid mempunyai aktivitas seperti anti fungal, anti inflamasi, anti HIV, anti diabetes, dan lain sebagainya.
Beberapa pembagian steroid antara lain:
1.      Sterol (steroid alkohol)
2.      Asam-asam empedu
3.      Steroid saponin          
4.      Hormon seks (estrogen, progestin, androgen)
5.      Hormon adrenal korteks (glikokortikosteroid mineralokortikosteroid)
6.      Kardiotonik steroid glikosida
7.      Hormon metamorfosis (ekdysteroid) pada serangga
Beberapa Steroid yang penting antara lain:
1.      Kolesterol
Kolesterol merupakan steroid hewani yang terdapat paling meluas dan dijumpai dalam hampir semua jaringan hewan. Batu kandung empedu dan kuning telur merupakan sumber yang kaya akan senyawa ini.
2.      Kortison dan kortisol (hidrokitoson)
Kortison dan kortisol (hidrokitoson) merupakan dua dari 28 hormon atau lebih hormon yang dihasilkan oleh lapisan luar kelenjar adrenal (adrenal kortex). Keduanya digunakan secara meluas untuk mengobati peradangan karena alergi atau encok (rhemautoid arthritis).
3.       Hormon seks
Hormon seks dihasilkan terutama dalam testis dan indung telur; produksinya diatur oleh hormon-hormon yang terdapat dalam otak (piturutary gland). Hormon-hormon seks menyiarkan karakteristik seks sekunder dan mengatur fungsi seksual dan reproduksi. Hormon-hormon jantan secara kolektif disebut endrogen; hormon betina estrogen; dan hormon kehamilan progestin.
4.       Asam-asam empedu (bile acids)
Asam-asam empedu dijumpai dalam kelenjar empedu, yang direproduksi dalam hati (liver) dan disimpan dalam kandung empedu itu. Contoh asam-asam empedu yang paling melimpah adalah  Asam kolat.[2]     

B.     Isolasi Bioaktifitas Metabolit Sekunder
1.      Uji Pendahuluan / Identifikasi kandungan Steroid
      Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senyawa kimia yang diinginkan dalam suatu tumbuhan maka perlu dilakukan uji pendahuluan kandungan senyawa metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, yaitu dalam hal ini bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan steroid dalam akar tumbuhan cendana. Identifikasi kandungan steroid dilakukan dengan cara: sepuluh gram akar tumbuhan S. album halus diekstraksi dengan metanol. Ekstrak metanol kemudian diuapkan dan diekstraksi dengan eter. Residu yang tidak larut dalam eter dikocok kuat-kuat. Adanya busa yang stabil selama 30 menit menunjukkan adanya saponin. Selanjutnya dihidrolisis dengan asam klorida 2 N sebanyak 4 ml dan disaring. Endapan diuji dengan pereaksi Liebermann-Burchard. Warna ungu menunjukkan adanya saponin. Ekstrak eter diuji dengan pereaksi Liebermann-Burchard. Warna hijau menunjukkan adanya steroid dan warna merah menunjukkan adanya triterpena. 
2.      Ekstraksi dan Fraksinasi
      Serbuk akar tumbuhan S. album sebanyak 2,0 kg diekstraksi secara maserasi dengan menggunakan pelarut metanol selama 24 jam sambil diaduk. Ekstrak metanol dipisahkan dengan cara penyaringan. Maserasi ini dilakukan selama 3 x 24 jam sehingga kandungan senyawa kimia dalam bahan terekstraksi semaksimal mungkin ke dalam pelarut metanol. Ekstrak metanol kemudian dipekatkan dengan menggunakan evaporator sampai diperoleh ekstrak metanol pekat (48,3 g; 2,415%).
      Ekstrak metanol pekat yang diperoleh diambil 250,0 mg untuk uji aktivitas hipoglisemik, sisanya sebanyak 40,0 g disuspensi dengan akuades dan difraksinasi dengan menggunakan pelarut kloroform. Selanjutnya masing-masing fraksi dipekatkan dan diuji steroid. Ternyata fraksi ekstrak CHCl3 positif steroid sedangkan fraksi air negatif steroid.
3.      Pemisahan dan Pemurnian
      Ekstrak kloroform yang menunjukkan positif steroid dipisahkan dengan cara kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 60 dan dielusi dengan menggunakan pelarut n-heksana–etil asetat dengan penampungan 5 ml setiap fraksi dan diperoleh sebanyak 170 fraksi. Semua fraksi hasil pemisahan kromatografi kolom selanjutnya dilakukan analisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis untuk melihat noda dengan Rf yang sama dengan fase gerak kloroform etil asetat. Fraksi-fraksi dengan noda yang sama pada kromatografi lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya. Dari 170 fraksi diperoleh 6 fraksi gabungan
                  Fraksi-fraksi yang menampakkan pola noda yang sama pada kromatogram lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh fraksi A (8-15) seberat 278,1 mg, fraksi B (19-26) seberat 99,7 mg, fraksi C (36-40) seberat 81,9 mg, fraksi D (52-59) seberat 51,9 mg, fraksi E (79-104) seberat 24,5 mg, dan fraksi F (128-170) seberat 50,0 mg. Keenam fraksi dilakukan uji steroid. Hasil uji steroid dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard terlihat bahwa fraksi D positif terhadap pereaksi steroid sehingga dilakukan pemisahan lebih lanjut. Fraksi D sebanyak 50 mg dipisahkan kembali dengan menggunakan kromatografi kolom dengan silika gel 60 menggunakan fase gerak petroleum eter–eter. Selanjutnya masing-masing fraksi ditampung sebanyak 1 ml dan diperoleh 43 fraksi. Setelah dilakukan kromatografi lapis tipis dengan fase gerak petroleum eter–eter, eluat ini menghasilkan empat fraksi yang menunjukkan pemisahan yang berbeda. Fraksi-fraksi yang menunjukkan noda dengan Rf yang sama pada kromatografi lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh fraksi D1  (12-15) seberat 13,2 mg, fraksi D2 (22-24) seberat 9,4 mg, fraksi D3  (33-34) seberat 11,4 mg, dan fraksi D4 (39-43) seberat 14,3 mg. Terhadap keempat fraksi dilakukan uji steroid. Hasil uji steroid diperoleh bahwa fraksi D1-D4 positif terhadap pereaksi Liberman-Burchard.
4.      Uji Kemurnian
      Kromatogram dari kromatografi lapis tipis  menunjukkan bahwa fraksi D3 memperlihatkan noda tunggal. Fraksi D3 yang memberikan noda tunggal tersebut kemudian dilakukan analisis kemurnian dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan berbagai fase gerak yaitu:

·         n-heksana-etilasetat (I)
·         n-heksana-kloroform (II)
·         petroleum eter-eter (III)
·         kloroform (IV) 
·         kloroform-metanol (V)


Ternyata dengan berbagai campuran dua fase gerak pada kromatografi lapis tipis semua kromatogram menunjukkan adanya noda tunggal. Dengan demikian dapat  disimpulkan bahwa fraksi D3 tersebut murni. Analisis selanjutnya dilakukan pengukuran titik leleh dengan alat “Fisher John Melting Point”. Pengamatan menunjukkan bahwa fraksi D3 meleleh pada suhu 135- 137C. [3]
C.    Penentuan Struktur Molekul
1.      Spektroskopi Inframerah (FTIR)
      Spektrum inframerah senyawa isolat murni ditunjukkan dalam Gambar 4 dan data bilangan gelombang, bentuk pita, intensitas dan gugus terkait dipaparkan pada Tabel 28.

      Tabel 1. Interpretasi spektrum inframerah (bilangan gelombang, bentuk pita, intensitas, dan penempatan gugus terkait) dari isolat.

Bilangan Gelombang
(v, cm-1)
Bentuk Pita
Intensitas
Penempatan Gugus Terkait
3417,36
Melebar
Sedang
ν O-H (ikatan hidrogen antarmolekul)
2936,87
Tajam
Kuat
ν C-H (pada CH3)
2868,34
Tajam
Sedang
ν C-H (pada CH2)
1661,53
Tajam
Sedang
ν C=C non konjugasi
1464,54
Tajam
Sedang
C-H pada (CH2)
1376,22
Tajam
Sedang
C-H pada (CH3)
1328,67
Tajam
Sedang
O-H
1051,74
Tajam
Sedang
C-OH (alkohol siklik sekunder)
956,64
T ajam
Sedang
=C-H out-of-plane

            Spektrum inframerah memperlihatkan bahwa senyawa yang diperoleh menunjukkan serapan melebar pada daerah bilangan gelombang   3417,36 cm-1 yang diduga adalah serapan uluran (stretching ) dari gugus O-H (3200–3550 cm-1). Dugaan ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah bilangan pada gelombang ν 1328,67 cm-1 yang menunujukkan adanya serapan tekukan (bonding) dari gugus O-H (1330-1420 cm-1) dan bilangan gelombang ν 1051,74 cm-1 yang menunjukkan adanya aluran C-OH siklik (990-1060 cm-1). Pita serapan pada daerah bilangan gelombang ini membaerikan gambaran bahwa senyawa isolasi merupakan senyawa siklik yang mengandung gugus OH.
            Kedudukan OH dalam molekul berada pada posisi 3β (ekuatorial) dapat diperlihatkan pada tabel 2 & Gambar 5.
Tabel 2. Korelasi frekuensi C-O dengan stereokimia.
Struktur
Konformasi
Uluran C-O cm-1
Steroid Alkohol
Steroid Metoksi
Steroid Asetat
A/B trans,
Ekuatorial
1037-1040
1100-1102
1025-1031
A/B trans,
Aksial
996-1002
1086
1013-1022
A/B cis,
Ekuatorial
1037-1044
1100
1026-1029
A/B cis, 3β
Aksial
1032-1036
1088-1090
1018-1022
5C=C, 3β
Ekuatorial
1050-1052
1104
1030
5C=C, 3α
Aksial
1034


A/B trans,
Ekuatorial
1030-1035


A/B trans,
Aksial
1010


A/B trans,
Ekuatorial
1040


A/B trans,
Aksial
1000




Terpenoid alkohol

Triterpenoid asetat
Ekuatorial
1013-1031

1023-1026


1040-1045


Aksial
1063-1068

1033-1040

      Adanya pita tajam dengan intensitas kuat pada bilangan gelombang v 2936,87 cm-1 adalah merupakan uluran C-H dari CH3 dan pita serapan pada bilangan gelombang v 2868,34 cm-1 merupakan uluran C-H pada CH2 (Hal ini diperkuat dengan adanya serapan pada daerah bilangan gelombang 1376,22 cm‑1 yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH3 (rocking, 1350-1370 cm-1) dan pita serapan pada bilangan gelombang 1464,54 cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH2 (scissoring, 1450-1470 cm‑1).
      Pita serapan pada bilangan gelombang v 1661,53 cm-1 yang tajam menunjukkan adanya uluran C=C non konjugasi (1620-1680 cm-1). Dugaan ini diperkuat dengan adanya serapan pada bilangan gelombang 956,64 cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan =C-H(650-1000 cm-1).
      Dari interprestasi data diatas dapat disimpulkan bahwa fraksi D3 mengandung inti siklik, hidroksi (3β, equatorial), aktif (CH3 dan CH2) dan ena non konjugasi (∆5).
2.      Spektroskopi NMR karbon
      Spektrum NMR karbon (100 MHz, CDCl3) dari fraksi D3 ditunjukkan dalam gambar 60 dan data pergeseran kimianya dipaparkan pada Tabel 3.
Gambar 6. Spektrum NMR-13C
No. peak
Pergeseran kimia(ppm)
No. Peak
Pergeseran kimia(ppm)
1
11,849
16
33,931
2
11,973
17
36,136
3
18,768
18
36,490
4
19,015
19
37,238
5
19,385
20
39,764
6
19,805
21
42,290
7
21,072
22
42,306
8
23,055
23
46,069
9
24,289
24
50,114
10
26,359
25
56,037
11
28,238
26
56,753
12
29,135
27
71,800(C-OH)
13
30,920
28
121,706(=CH2)
14
31,652
29
140,752(=C-R)
15
31,891
CDCl3
77,000(t)
 
      Spektrum NMR-13 menunjukkan bahwa terdapat 29 atom karbon (Lampiran 13)penyusun fraksi D3. Spectrum NMR-13 C menyatakan adanya group hidroksil (ᵟc=71,800) dan dua group ena (ᵟc=121,706 dan ᵟc 140,752). Perbandingan data NMR-13 C. Hasil penelitian dengan data literatur ditunjukkan dalam Tabel 4.
Peak
Hasil
Literatur
Dugaan
Peak
Hasil
Literatur
Dugaan
1
11,849
11,87
C-19
16
33,931
33,92
C-22
2
11,973
12,32
C-29
17
36,136
36,28
C-20
3
18,768
18,84
C-21
18
36.490
36,52
C-10
4
19,015
18,98
C-26
19
37.238
37,27
C-1
5
19,385
19,41
C-19
20
39.764
39,78
C-12
6
19,805
19,61
C-27
21
42,290
42,31
C-4
7
21,072
21,10
C-11
22
42,306
42,33
C-13
8
23,055
23,02
C-28
23
46,069
46,07
C-24
9
24,289
24,32
C-15
24
50,114
50,14
C-9
10
26,359
26,38
C-23
25
56,037
56,08
C-17
11
28,238
28,25
C-16
26
56,753
56,77
C-14
12
29,135
28,95
C-25
27
71,800(C-OH)
71,84
C-3
13
30,920
31,68
C-2
28
121,706(=CH2)
121,72
C-6
14
31,652
31,92
C-7
29
140,76(=C-R)
140,76
C-5
15
31,891
31,93
C-8





3.      Spektroskopi Massa
      Spektrum massa dari fraksi D3 ditunjukkan dalam gambar 7. Senyawa dengan massa 414 dan mempunyai inti siklik, hidroksil, alkana dan alkena melalui penelusuran pustaka ada 8 senyawa.
      Ada 3 struktur yang sesuai dengan data dari spektrum IR dan NMR-13C. Struktur tersebut adalah sebagai berikut:
1)         24-etil-5α-kolest-5-en-3β-ol(5)
24-etil-5α-kolest-5-en-3β-ol mempunyai gugus fungsi siklik, hidroksil dan alkena. Data dari NMR-12C adalah sebagai berikut:

Gugus Fungsi
Jumlah C
Jumlah H
Jumlah O
CH3     6 buah
6
18
-
CH2   11 buah
11
22
-
CH 9 buah
9
9
-
C  3 buah
3
-
-
OH 1 buah
-
1
1







2)         24-etil-5α-kolest-7-en-3β-ol(7)
24-etil-5α-kolest-7-en-3β-ol mempunyai gugus fungsi siklik, hidroksil dan alkena. Data dari NMR-12C adalah sebagai berikut:
Gugus Fungsi
Jumlah C
Jumlah H
Jumlah O
CH3     6 buah
6
18
-
CH2   11 buah
11
22
-
CH 9 buah
9
9
-
C  3 buah
3
-
-
OH 1 buah
-
1
1


3)          




24-etil-5α-kolest-14-en-3β-ol(12)
24-etil-5α-kolest-14-en-3β-ol mempunyai gugus fungsi siklik, hidroksil dan alkena. Data dari NMR-12C adalah sebagai berikut:
Gugus Fungsi
Jumlah C
Jumlah H
Jumlah O
CH3     6 buah
6
18
-
CH2   11 buah
11
22
-
CH 9 buah
9
9
-
C  3 buah
3
-
-
OH 1 buah
-
1
1







      Spektrum fraksi D3 menunjukkan bahwa tidak ada ion peak yang menyolok dengan m/z 229 yang merupakan ion peak karakteristik untuk sterol dengan ikatan rangkap dua pada C-7, tetapi dalam spektrum menunjukkan ion peak dengan m/z 231 yang merupakan fragmentasi dari ∆5 sterol terjadi karena pemutusan rantai samping yang terikat dengan rantai. C3H6 sehingga menghasilkan ion dengan ion dengan m/z 231 [M. RS. 42]+. Bila spektrum fraksi D3 dibandingkan dengan spektrum literatur diperoleh bahwa spektrum fraksi D3 dibandingkan dengan spektrum literatur diperoleh bahwa spektrum ini sangat mirip dan mempunyai fragmentasi yang sam


D.    Uji Bioaktivitas Senyawa Steroid
1.      Pembuatan Suspensi Ekstrak Metanol Santalum album 1% (b/v)
Sebanyak 0,5 g CMC ditaburkan ke dalam mortir yang berisi akuades panas ( 60C) sebanyak 10 ml, ditutup dan dibiarkan  15 menit hingga diperoleh massa transparan, lalu digerus hingga homogen. Ke dalam 250 mg ekstrak metanol akar S. album yang telah digerus halus dalam mortir ditambahkan gel CMC sedikit demi sedikit. Kemudian ditambahkan akuades, diaduk dengan cepat hingga terbentuk suspensi, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, dicukupkan dengan akuades hingga garis tanda. 
2.      Prosedur Kerja Pengujian Efek Farmakologi
Setiap awal percobaan, mencit dipuasakan (tidak makan tetapi tetap minum) selama 16 jam, kemudian berat badan mencit ditimbang. Kadar gula darah ditentukan dengan cara mengambil darah melalu vena ekor yang ditusuk dengan menggunakan jarum suntik. Darah yang keluar dioleskan pada glikostrip yang terpasang pada glucotest. Dibiarkan selama 8 detik, alat akan bekerja secara otomatis. Angka yang tampil pada alat dicatat sebagai kadar gula darah (mg/dl). 
3.      Uji Aktivitas Hipoglisemik
Mencit dipuasakan selama 16 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan diukur kadar gula darah puasa. Mencit kemudian diberi larutan glukosa 50% dosis 4 g/kg berat badan secara per oral. Kadar gula darah mencit diukur pada selang waktu 30, 60, 90, 120, 150, 180 menit. Cara penentuan kadar gula darah mencit sama seperti point 3.5.6.5. 
4.      Penentuan Efek Ekstrak Metanol Akar S.album Terhadap Penurunan Kadar Gula Darah
Mencit dipuasakan selama 16 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan diukur kadar gula darah puasa. Kemudian mencit diberi larutan glukosa 50% dosis 4 g/kg berat badan secara per oral. Setelah 30 menit diukur kadar gula darah mencit, kemudian masing-masing mencit diberi:
a.       Suspensi kosong (CMC 0,5%) dosis 1% berat badan per oral
b.      Suspensi ekstrak metanol akar S. album dosis 25 mg/kg berat badan per oral
c.        Suspensi ekstrak metanol akar S. album dosis 50 mg/kg berat badan per oral
d.      Suspensi ekstrak metanol akar S. album dosis 75 mg/kg berat badan per oral
e.       Suspensi glibenklamid dosis 1 mg/kg berat badan per oral
Kadar gula darah diukur pada selang waktu 60, 90, 120, 150, dan 180 menit.

5.      Prosedur Penggunaan
a.       Pengambilan darah mencit dalam keadaan puasa dilakukan dengan cara menyuntik ekor mencit dengan menggunakan syringe.
b.      Ekor yang telah disuntik dengan syringe kemudian diurut ke bawah dengan tujuan agar darah keluar. 
c.       Kemudian darah mencit tersebut disentuhkan pad strip sampai terisi penuh. Pada layar akan muncul angka 8 dan dibiarkan menghitung mundur hingga keluar hasil pengukuran.
d.      Kemudian mencit diberikan larutan glukosa melalui oral dan masing-masing mencit diberikan CMC 1%, suspensi 25, 50, 75 mg/kg BB dan suspensi glibenklamid. Untuk pengukuran selanjutnya digunakan strip yang baru.

III.             KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pembahasan di atas bahwa penentuan senyawa terhadap tumbuhan Santalum album Linn, maka dapat diambil beberapa kesimpulan yaitu:
a.       Fraksi D3 merupakan senyawa steroid berupa Kristal putih dengan berat 11,4 mg dari 4,2309 g fraksi kloroform, berbentuk jarum dengan titik leleh 135-1370C.
b.      Penentuan struktur kimia dengan menggunakan spektroskopi Inframerah, Spektroskopi NMR Karbon, Spektroskopi Massa  menunjukkan bahwa isolate merupakan senyawa steroid yang tersusun dari 29 atom karbon.
c.       Ekstrak methanol dari akar tumbuhan S. album Linn yang mengandung steroid di lakukan uji aktifitas hipoglisemik ternyata mempunyai aktivitas hipoglisemik pada dosis 50 mg/kg BB.
d.      Hasil isolasi steroid daru akar tumbuhan cendana bermanfaat untuk obat diabetes alami yang ramah terhadap lingkungan dan murah sehingg dapat diaplikasikan dalam bidang kesehatan.


IV.             PENUTUP
Demikian makalah ini kami sampaikan, namun kami sadar makalah ini masih  jauh dari kesempurnaan. Maka dari itu kritik dan saran yang bersifat konstruktif dan inovatif sangat kami harapkan. Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kita semua, serta menambah khasanah keilmuan kita semua. Amin



DAFTAR PUSTAKA
Fessenden-Fessenden.(1992) Kimia Organik Jilid 2,Jakarta: Erlangga.
Saleh, Chairul, , Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar Tumbuhan Cendan (Santalum Album Linn), USU e-Reposetory, 2008


[1] http://pengalamantryout.blogspot.com/2009/04/pohon-cendana-manfaat.html
[2] Fessenden-Fessenden, Kimia Organik Jilid 2,(Jakarta: Erlangga, 1982), hlm 425-427
[3] Chairul Saleh, Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar Tumbuhan Cendan (Santalum Album Linn), USU e-Reposetory, 2008

0 komentar:

Posting Komentar