I.
PENDAHULUAN
Flavonoid
merupakan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman hijau, kecuali
alga. Flavonoid yang lazim ditemukan pada tumbuhan tingkat tinggi (angiospermae) adalah flavon dan flavonol
dengan dengan C- dan O-glikosida , isoflavon C- dan O-glikosida, flavanon C-
dan O-glikosida, khalkon dengan C- dan O-glikosida dan ihidrokhalkon,
proantosiaanidin dan antosianin,auron O-glikosida, dan dihidroflavonol O-glikosida.
Istilah flavonoid diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang berasal dari kata
flavon, yaitu nama salah satu flavonoid yang jumlahnya paling besar di
tumbuhan.
Kemuning
dengan nama latinnya Murraya panicullata L. Jack dan sinonim Murraya
exotica termasuk suku jeruk-jerukan, merupakan perdu atau pohon kecil
bercabang banyak dan merupakan salah satu tanaman yang digunakan untuk obat
tradisional seperti obat sakit gigi, infeksi saluran kencing, ulcerpain,
memarterpukul, sakit reumatik, gigitan serangga, gigitan ular,bisul dan koreng.
Rebusan daun kemuning ini digunakan pula untuk mengobati haid yang tidak
teratur, lemak tubuh berlebihan serta untuk memperkuat kontraksi uterus bagi
ibu yang habis melahirkan.
Pengujian daun kemuning ini, dimaksudkan untuk mengetahui
apakah dalam daun kemuning mengandung flavonoid atau tidak. Apabila dalam daun
kemuning positif mengandung kemuning, jenis flavonoid apa yang terkandung di
dalamnya.
II.
RUMUSAN MASALAH
A.
Pengertian dan Klasifikasi Flavonoid
B.
Isolasi Bioaktif (Metabolit Sekunder)
C.
Pemurnian (Purification)
D.
Elusidasi (Penentuan Struktur)
E.
Uji Bioaktifitas
III.
PEMBAHASAN
A.
Pengertian dan
Klasifikasi Flavonoid
Flavonoid adalah salah
satu senyawa fenolik alam selain poliketida dan fenolpropanoid. Flavonoid
umumnya tersebar di dunia tumbuhan. Lebih dari 2000 flavonoid yang
berasal dari tumbuhan telah diidentifikasi, namun ada tiga kelompok yang umum
dipelajari, yaitu antosianin, flavonol, dan flavon. Antosianin (dari bahasa Yunani anthos ,
bunga dan kyanos, biru-tua) adalah pigmen berwarna yang umumnya terdapat
di bunga berwarna merah, ungu, dan biru . Pigmen ini juga terdapat di berbagai
bagian tumbuhan lain misalnya, buah tertentu, batang, daun dan bahkan akar.
Flavonoid sering terdapat di sel epidermis. Sebagian besar flavonoid tersimpan
di vakuola
sel tumbuhan walaupun tempat sintesisnya ada di luar vakuola.
Warna warni flavonoid
ditimbulkan oleh sistem konyugasi electron dalam senyawa aromatik tersebut.
Kerangka dasar flavonoid dibangun dari
15 atom karbon yang terdiri dari dua bagian cincin benzene yang dihubungkan
oleh rantai karbon propana, secara sangat sederhana dapat dituliskan C6-C3-C6.[1]
Formula ini dapat membentuk konfigurasi yang kemudian menghasilkan tiga macam
struktur dasar berupa 1,3 diarilpropan (flavonoid), 1,2 diarilpropan
(isoflavonoid) dan 1,1 diarilpropan (neoflavonoid)
Istilah flavonoid
diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang berasal dari kata flavon, yaitu nama
salah satu jenis flavonoida yang terbesar jumlahnya dalam tumbuhan.
Senyawa-senyawa flavon ini mempunyai kerangka 2-fenilkroman, dimana posisi orto
dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada B dari cincin 1,3-diaril
propanan dihubungkan oleh jembatan oksigen sehingga membentuk cincin
heterosiklik yang baru. Kelas-kelas yang berlainan dalam golongan ini dibedakan
berdasarkan cincin heterosiklik-oksigen tambahan dan gugus hidroksil yang
tersebar menurut pola yang berlainan. Flavonoid sering terdapat sebagai
glikosida.
Golongan terbesar flavonoid berciri mempunyai piran yang
menghubungkan rantai tiga-karbon dengan salah satu dari cincin benzene.
Berbagai macam senyawa flavonoid utama yang terdapat di alam, antara lain:
1)
Katekin dan proantosianidin
Katekin
dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai banyak kesamaan.
Semuanya senyawa terwarna, terdapat pada seluruh dunia tumbuhan berkayu.kita
hanya mengenal tiga jenis katekin, perbedaannya hanya pada jumlah gugus
hidroksil pada cincin B. Senyawa ini mempunyai dua atom karbon kiral dan karena
itu mungkin terdapat 4 isomer.
2)
Flavanon dan Flavanonol
Senyawa
ini terdapat hanya sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoid lain.
Mereka terwarna atau hanya kuning sedikit. Karena konsentrasinya rendah dan
tidak berwarna maka sebagian besar diabaikan. Flavanon (atau dihidroflavanon)
sering terjadi sebagai aglikon (60) tetapi beberapa glikosidanya dikenal
sebagai misalnya, hesperidin dan naringin dari kulit buah jeruk. Flavanonol
merupakan flavonoid yang kurang dikenal, dan kita tidak mengetahui apakah
senyawa ini terdapat sebagai glikosida.
3)
Flavon, flavanol, isoflavon
Flavon
atau flavonol merupakan senyawa yang paling tersebar luas dari semua semua
pigmen tumbuhan kuning, meskipun warna kuning tumbuhan jagung disebabkan oleh
karatenoid. Isoflavon tidak begitu menonjol, tetapi senyawa ini penting sebagai
fitoaleksin. Senyawa yang lebih langka lagi ialah homoisoflavon. Senyawa ini
biasanya mudah larut dalam air panas dan alkohol meskipun beberapa flvonoid
yang sangat termitalasi tidak larut dalam air
4)
Auron
Auron
atau system cincin benzalkumaranon dinomori sebagai berikut: Auron berupa pigmen kuning emas terdapat
dalam bunga tertentu dan bryofita. Dikenal hanya lima aglikon, tetapi pola
hidroksilasi senyawa ini umumnya serupa dengan pola pada flavonoid lain begitu
pula bentuk yang dijumpai ialah bentuk glikosida dan eter metil. Dalam larutan
basa senyawa ini menjadi merah ros. Beberapa auron, struktur dan tumbuhan
sumber terdapat dalam contoh dibawah ini.
B.
Isolasi Bioaktif (Metabolit Sekunder)
1)
Uji pendahuluan / identifikasi kandungan flavonoid
Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senyawa kimia
yang diinginkan dalam suatu tumbuhan maka perlu dilakukan uji pendahuluan
kandungan senyawa metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, yaitu
dalam hal ini bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan flavonoid dalam
daun kemuning. Identifikasi kandungan flavonoid dilakukan dengan cara: lebih
kurang 4 gram sampel daun kemuning dipanaskan dengan methanol 10 mL kemudian
disaring, filtrate ditambahkan 3 tetes asam klorida pekat, kemudian ditambahkan
serbuk logam magnesium. Jika timbul warna merrah atau jinga berarti positif
mengandung flavonoid. Sebagai pembanding digunakan daun legundi (Vitex
Trifolia) dengan pelakuan yang sama, dimana legundi mempunyai kadar
relative 0,05 % dengan lambing ++.[2]
2)
Ekstraksi dan fraksinasi
Secara umum ekstraksi senyawa meabolit sekunder
dari seluruh tumbuhan seperti bunga, buah dan kulit maupun akar mengunakan
system maserasi menggunakan pelarut organic polar seperti matanol. Namun disini
kita menggunakan sokletasi dengan pelarut n heksana dan methanol. Metode
ekstraksi lain yang sering digunakan adalah perkolasi, destilasi uap dan
pengempaan.
Sampel daun kemuning yang telah dikumpulkan
dirajang halus kemudian dikering anginkan. Setelah kering, sebanyak 800 g
sampel disoklet terlebih dahulu menggunakan pelarut n-heksana. Ekstrak yang
didapat diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator, maka akan
diperoleh ekstrak pekat fraksi n-heksana. Setelah proses ekstraksi dengan
n-heksana selesai maka proses sokletasi ini dilanjutkan dengan menggunakan
pelarut metanol. Ekstrak metanol di pekatkan in vacuo, maka akan
diperoleh ekstrak pekat fraksi metanol. Hasil ekstraksi 800 g sampel kering
daun Murraya panicullata L.Jack atau daun kemuning ini diperoleh
ekstrak kental fraksi n-heksana sebanyak 4,6 g dan ekstrak kental fraksi
metanol sebanyak 18,2 g.
Sebanyak 1 gram ekstrak pekat fraksi metanol di
kromatografi kolom menggunakan silika gel sebagai fasa diam dan elusi
bergradient menggunakan eluen campuran n-heksana-etil asetat,etil asetat- metanol dan metanol. Fraksi yang
keluar dari kolom ditampung dengan vial/tabung reaksi dan dimonitor dengan
kromatografi lapisan tipis dengan eluen campuran etil asetat-metanol dengan
perbandingan 9 : 1, didapat 16 (enam belas) fraksi gabungan.
Spot yang terlihat pada KLT di bawah lampu UV
memperlihatkan fluoresensi yang menunjukkan adanya konjugasi fenolik, diduga
adanya senyawa flavonoid. Ini konsistensi dengan penapisan fitokimia yang
menunjukkan adanya senyawa flavonoid pada daun kemuning. Fraksi 13 positif
mengandung flavonoid, memberikan satu noda yang berfluoresensi kuning dengan
KLT kemudian pelarutnya diuapkan dan direkristalisasi dengan metanol. Setelah
pelarutnya menguap maka diperoleh kristal jarum berwarna kuning pucat sebanyak
30 mg
C.
Pemurnian / purification
Proses pemisahan dan pemurnian bertujuan untuk
mendapatkan senyawa murni dari fraksi yang ada. Dimana dalam hal ini difokuskan
pada pemisahan dan pemurnian fraksi senyawa metanol. Sebanyak 1 gram ekstrak
pekat fraksi metanol di kromatografi kolom menggunakan silika gel sebagai fasa
diam dan elusi bergradient menggunakan eluen campuran n-heksana-etil
asetat,etil asetat- metanol dan metanol.
Fraksi yang keluar dari kolom ditampung dengan vial/tabung reaksi dan dimonitor
dengan kromatografi lapisan tipis dengan eluen campuran etil asetat-metanol
dengan perbandingan 9 : 1, didapat 16 (enam belas) fraksi gabungan.
Spot yang terlihat pada KLT dibawah lampu UV
memperlihatkan fluoresensi yang menunjukkan adanya konjugasi fenolik, diduga
adanya senyawa flavonoid. Ini konsistensi dengan penapisan fitokimia yang
menunjukkan adanya senyawa flavonoid pada daun kemuning. Fraksi 13 positif
mengandung flavonoid, memberikan satu noda yang berfluoresensi kuning dengan
KLT kemudian pelarutnya diuapkan dan direkristalisasi dengan metanol. Setelah
pelarutnya menguap maka diperoleh kristal jarum berwarna kuning pucat sebanyak
30 mg.
Untuk memastikan bahwa senyawa flavonoid hasil
isolasi ini sudah murni maka dilakukan uji titik leleh terhadap senyawa hasil
isolasi diperoleh TL 195-1960 C, jarak titik leleh sebesar 10C
menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi ini sudha murni. Hal ini juga ditunjang
dengan data KLT pada beberapa eluen yang
tetap memberikan satu noda.
Dengan pengungkap noda lampu Uv254 nm
dan uap I2 dengan Rf yang dicantumkan pada table2. Oleh sebab itu
selanjutnya dapat dilakukan karakterisasi dengan spectrum UV dan IR.
Table 2.
hasil pengujian kromatografi lapisan tipis senyawa hasil isolasi dengan
berbagai eluen dan penampak noda
No
|
Eluen
|
Rf
|
Pengamatan dengan penampak noda
|
||
Lampu UV
|
NaOH + lampu UV
|
Uap I2
|
|||
1
|
N heksana
|
0,00
|
Satu noda berflourensi kuning
|
Satu noda berflourensi kuning terang
|
Satu noda coklat
|
2
|
Kloroform
|
0,10
|
Satu noda berflourensi kuning
|
Satu noda berflourensi kuning terang
|
Satu noda coklat
|
3
|
Etil asetat
|
0,14
|
Satu noda berflourensi kuning
|
Satu noda berflourensi kuning terang
|
Satu noda coklat
|
4
|
metanol
|
0,72
|
Satu noda berflourensi kuning
|
Satu noda berflourensi kuning terang
|
Satu noda coklat
|
D.
Elusidasi / penentuan struktur
Secara umum elusidasi struktur senyawa dapat
dilakukan dengan metode fisika antara lain : rumus molekul (molekuler formula),
rotasi spsific, dan indeks refraktif, selain itu juga biisa menggunakan metode
spectra misalnya UV, IR MS, dan NMR.
1)
Elusidasi dengan UV
Senyawa hasil isolasi
yang dikarakterisasi dengan spektrofotometer UV mempergunakan pelarut metanol
memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 273,1 nm (pita II) , 305 nm
(bahu) dan 347,2 nm (pita I) terlihat pada lampiran 1. Interpretasi spektrum UV
mendukung data sebelumnya bahwa senyawa hasil isolasi ini adalah flavonoid,
dimana menurut Markham (1988), flavon (apigenin) mempunyai spektrum UV pada
pita II dengan λ maks 250-280 nm dan pita I dengan λ maks 310-350. Serapan yang menyebabkan
terjadinya pita II karena adanya eksitasi elektron dari p ke p pada cincin
benzoid (cincin B). Pita I dihasilkan karena adanya transisi elektronik
dari n ke p pada gugus karbonil yang
terkonyugasi oleh cincin A.
2)
Elusidasi dengan IR
Karakterisasi senyawa hasil isolasi
dengan spektrofotometer IR memberikan serapan pada angka gelombang υKBrMax
cm-1 : 3260,1660, 1620, 1520, 1440, 1365, 1285, 1260, 1225,
1200, 1175, 1145, 1125, 1080, 1040, 1010, 940, 860, 835, 780 dan 745. Interpretasi
spektrum inframerah didapatkan puncak-puncak yang penjabarannya sebagai
berikut: serapan pada angka gelombang 3260 cm-1 merupakan serapan OH
fenol yang mempunyai ikatan hidrogen. Cincin aromatis ditunjukkan oleh puncak
yang muncul pada daerah 1650-1450 cm-1 senyawa hasil isolasi memberikan puncak
sekitar 1620 cm dan 1520 cm-1 yang merupakan renggangan
C=C aromatis dan didukung oleh pita serapan pada 860 cm-1 - 835 cm-1,
940 cm-1 serta pada daerah 1440 cm-1 terdapat pita
yang sangat kuat dan tajam yang merupakan regangan cincin aromatis.
Senyawa hasil isolasi memperlihatkan serapan
pada angka gelombang 1660 cm-1 yang mengindikasikan serapan untuk
gugus karbonil C=O, didukung oleh puncak
1145 cm-1. Menurut literatur
regang C=O yang karaktristik untuk senyawa-senyawa flavonoid adalah 1700-1750 cm-1
yang didukung oleh adanya puncak pada daerah sidik jari dengan angka gelombang
1158 cm-1.
Serapan karbonil senyawa hasil
isolasi ini lebih kecil karena adanya konyugasi ikatan rangkap. Senyawa
karbonil disini adalah golongan ester yang diperkuat oleh puncak-puncak yang
kuat pada daerah 1300-1000 cm-1.
E.
Uji bioaktifitas (Bioassay) fraksi n-Heksana, fraksi
Metanol, dan senyawa hasil isolasi
Masing-masing fraksi (fraksi n-heksana, fraksi
metanol) dan juga senyawa murni dilakukan uji aktivitas Sitotoksik dengan
metoda Brine shrimp menggunakan anak udang air laut (Artemia salina
Leach), dengan cara disiapkan 9 vial untuk tiga konsentrasi masing-masing
larutan uji 1000, 100, 10 μg/ml serta satu vial untuk kontrol. Larutan induk
dibuat dengan melarutkan 20 mg sampel uji dalam 2 ml metanol. Larutan induk
tersebut sebanyak 500, 50,5 μl berturut-turut dimasukkan kedalam masing-masing
vial yang telah disiapkan untuk konsentrasi 1000, 100, 10 μg/ml.[3]
Vial yang berisi larutan uji dikeringkan dalam
desikator sampai semua pelarutnya menguap, kemudian ditambahkan 50 μl DMSO
termasuk vial kontrol untuk melarutkan sampel kembali. Selanjutnya ditambah 2
ml air laut. Larva Artemia salina Leach sebayak 10 ekor dimasukkan
kedalam setiap larutan uji dan kontrol,- dicukupkan volumenya sampai 5 ml
dengan air laut, diletakkan dibawah sinar lampu selama 24 jam. Setelah 24 jam
diamati dan dihitung jumlah larva udang yang mati. Dari data yang diperoleh,
dihitung nilai LC50 nya dengan analisis probit atau program komputer
Finney.
Uji aktifitas sitotoksik dengan metoda Brine
Shrimp Lethality Test terhadap senyawa murni hasil isolasi memberikan LC50
194,786 μg/ml. Artinya senyawa ini (hasil isolasi) tidak menimbulkan efek
toksik terhadap larva Artemia Salina Leach. Sesuai dilaporkan oleh Meyer
et.al., 1982 bahwa ekstrak suatu
tumbuhan mempunyai aktifitas sitotoksik jika memberikan LC50 lebih
dari sama dengan 1000 μg/ml. [4] Sedangkan
untuk fraksi n heksana dan methanol dapat diketahui fraksi yang paling aktif dilihat dari harga LC50, dengan
hasil sebagai berikut:
Tabel 1. Hasil Uji Hayati Brine Shrimp
Lethality Test.
Ekstrak Daun Kemuning
|
Jenis Ekstrak LC50 (μg/ml)
|
Fraksi n-heksana 6375
|
6375
|
Fraksi Metanol 707,64
|
707,64
|
Fraksi methanol positif mengandung flavonoid dengan
test sianidin juga mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap Arhtemia Salina
yang ditunjukkan oleh LC50 lebih dari 1000 μg/ml. Sedangkan fraksi n
heksana tidak mengandung falvonoid dan tidak mempunyai aktivitas sitotolsik
terhadap Arhtemia Salina yang ditunjukkan oleh LC50 kurang
dari 1000 μg/ml.
IV.
KESIMPULAN
Dari 1 gram fraksi methanol ekstrak daun kemuning, didapat senyawa
flavonoid golongan flavon (apigenin) berupa Kristal berwarna kuning muda dari
daun kemuning dengan titik leleh 195-196 0C. dari hasil uji BSLT
terhadap senyawa ini tidak menimbulkan efek toksik terhadap larva Artemia
Salina Leach dengan LC50 194,786 μg/ml
V.
PENUTUP
Demikianlah makalah ini
kami sampaikan kepada para pembaca, semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi
para pembaca berkenaan tentang isolasi senyawa flavonoid, Tentunya kami
sadar bahwa makalah kami jauh dari sempurna, karena keterbatasan manusiawi
kami. Untuk itu kritik dan saran yang konstruktif selalu kami nanti untuk
kemajuan ilmu pengetahuan kita bersama. Happy reading
DAFTAR PUSATAKA
Hanapi Usman, 2002, Kimia Organik Bahan
Alam, Makasar: tp.
Markham. R. 1988, Cara Mengidentifikasi
Senyaa Flavonoid, Bandung : ITB
Meyer et al., 1982, Brine Shrimp A
Convention General Bioassays For Active Plant Constituens, Planta Med, 45
Morina Adfa / Jurnal Gradien Vol. 3 No. 2
juli 2007 : 262-266
0 komentar:
Posting Komentar